Novinky - Monitorovanie hladín rozpusteného kyslíka v procese biofarmaceutickej fermentácie

Čo je rozpustený kyslík?

Rozpustený kyslík (DO) sa vzťahuje na molekulárny kyslík (O_₂), ktorý je rozpustený vo vode. Líši sa od atómov kyslíka prítomných v molekulách vody (H_₂O), pretože existuje vo vode vo forme nezávislých molekúl kyslíka, buď pochádzajúcich z atmosféry, alebo generovaných fotosyntézou vodných rastlín. Koncentráciu rozpusteného kyslíka ovplyvňujú rôzne faktory vrátane teploty, slanosti, prietoku vody a biologickej aktivity. Ako taká slúži ako kritický ukazovateľ pre hodnotenie zdravotného stavu a stavu znečistenia vodného prostredia.

Rozpustený kyslík hrá dôležitú úlohu pri podpore mikrobiálneho metabolizmu, ovplyvňuje bunkové dýchanie, rast a biosyntézu metabolických produktov. Vyššie hladiny rozpusteného kyslíka však nie sú vždy prospešné. Nadbytok kyslíka môže viesť k ďalšiemu metabolizmu nahromadených produktov a potenciálne spôsobiť toxické reakcie. Optimálne hladiny rozpusteného kyslíka sa líšia medzi rôznymi bakteriálnymi druhmi. Napríklad počas biosyntézy penicilínu sa rozpustený kyslík zvyčajne udržiava na približne 30 % nasýtení vzduchom. Ak rozpustený kyslík klesne na nulu a zostane na tejto úrovni päť minút, tvorba produktov môže byť výrazne narušená. Ak tento stav pretrváva 20 minút, môže dôjsť k nezvratnému poškodeniu.

V súčasnosti najčastejšie používané senzory rozpusteného kyslíka dokážu merať iba relatívnu saturáciu vzduchom, nie absolútnu koncentráciu rozpusteného kyslíka. Po sterilizácii kultivačného média sa vykonáva prevzdušňovanie a miešanie, kým sa hodnota senzora nestabilizuje, načo sa hodnota nastaví na 100 % saturáciu vzduchom. Následné merania počas fermentačného procesu sú založené na tejto referencii. Absolútne hodnoty rozpusteného kyslíka nie je možné určiť pomocou štandardných senzorov a vyžadujú si pokročilejšie techniky, ako je polarografia. Merania saturácie vzduchom sú však vo všeobecnosti postačujúce na monitorovanie a riadenie fermentačných procesov.

V rámci fermentora sa hladiny rozpusteného kyslíka (DO) môžu v rôznych oblastiach líšiť. Aj keď sa v jednom bode dosiahne stabilná hodnota, v určitých kultivačných médiách sa môžu stále vyskytovať výkyvy. Väčšie fermentory majú tendenciu vykazovať väčšie priestorové variácie hladín DO, čo môže významne ovplyvniť mikrobiálny rast a produktivitu. Experimentálne dôkazy ukázali, že hoci priemerná hladina DO môže byť 30 %, fermentačný výkon za kolísavých podmienok je výrazne nižší ako za stabilných podmienok. Preto pri zväčšovaní fermentorov – okrem zohľadnenia geometrickej a výkonovej podobnosti – zostáva minimalizácia priestorových variácií DO kľúčovým cieľom výskumu.

Prečo je monitorovanie rozpusteného kyslíka nevyhnutné pri biofarmaceutickej fermentácii?

1. Udržiavať optimálne prostredie pre rast mikroorganizmov alebo buniek
Priemyselná fermentácia typicky zahŕňa aeróbne mikroorganizmy, ako je Escherichia coli a kvasinky, alebo cicavčie bunky, ako sú napríklad bunky vaječníkov čínskeho škrečka (CHO). Tieto bunky fungujú ako „pracovníci“ vo fermentačnom systéme a vyžadujú kyslík na dýchanie a metabolickú aktivitu. Kyslík slúži ako terminálny akceptor elektrónov pri aeróbnom dýchaní, čo umožňuje produkciu energie vo forme ATP. Nedostatočný prísun kyslíka môže viesť k uduseniu buniek, zastaveniu rastu alebo dokonca k smrti buniek, čo v konečnom dôsledku vedie k zlyhaniu fermentácie. Monitorovanie hladín rozpusteného kyslíka zabezpečuje, že koncentrácie kyslíka zostávajú v optimálnom rozsahu pre trvalý rast a životaschopnosť buniek.

2. Zabezpečiť efektívnu syntézu cieľových produktov
Cieľom biofarmaceutickej fermentácie nie je len podpora proliferácie buniek, ale aj uľahčenie efektívnej syntézy požadovaných cieľových produktov, ako sú inzulín, monoklonálne protilátky, vakcíny a enzýmy. Tieto biosyntetické dráhy často vyžadujú značný energetický vstup, primárne pochádzajúci z aeróbneho dýchania. Okrem toho mnohé enzymatické systémy zapojené do syntézy produktov priamo závisia od kyslíka. Nedostatok kyslíka môže narušiť alebo znížiť účinnosť týchto dráh.

Okrem toho hladiny rozpusteného kyslíka pôsobia ako regulačný signál. Nadmerne vysoké aj nízke koncentrácie rozpusteného kyslíka môžu:
- Zmeniť bunkové metabolické dráhy, napríklad prechodom z aeróbneho dýchania na menej efektívnu anaeróbnu fermentáciu.
- Spúšťajú bunkové stresové reakcie, čo vedie k produkcii nežiaducich vedľajších produktov.
- Ovplyvňujú hladiny expresie exogénnych proteínov.

Presnou reguláciou hladín rozpusteného kyslíka v rôznych štádiách fermentácie je možné riadiť bunkový metabolizmus smerom k maximálnej syntéze cieľového produktu, čím sa dosiahne fermentácia s vysokou hustotou a vysokým výťažkom.

Úvod do diagramu toku vody pre biofarmaceutické výrobky

3. Na prevenciu nedostatku alebo nadbytku kyslíka
Nedostatok kyslíka (hypoxia) môže mať vážne následky:
- Rast buniek a syntéza produktov sa zastavia.
- Metabolizmus sa presúva na anaeróbne dráhy, čo vedie k akumulácii organických kyselín, ako je kyselina mliečna a kyselina octová, ktoré znižujú pH kultivačného média a môžu otráviť bunky.
- Dlhodobá hypoxia môže spôsobiť nezvratné poškodenie, pričom zotavenie je neúplné aj po obnovení prísunu kyslíka.

Nadbytok kyslíka (presýtenie) tiež predstavuje riziká:
- Môže vyvolať oxidačný stres a tvorbu reaktívnych foriem kyslíka (ROS), ktoré poškodzujú bunkové membrány a biomolekuly.
- Nadmerné prevzdušňovanie a miešanie zvyšujú spotrebu energie a prevádzkové náklady, čo vedie k zbytočnému plytvaniu zdrojmi.

4. Ako kritický parameter pre monitorovanie v reálnom čase a riadenie spätnej väzby

Rozpustený kyslík (DO) je parameter v reálnom čase, kontinuálny a komplexný, ktorý odráža vnútorné podmienky fermentačného systému. Zmeny hladín DO môžu citlivo indikovať rôzne fyziologické a prevádzkové stavy:
- Rýchly rast buniek zvyšuje spotrebu kyslíka, čo spôsobuje pokles hladín rozpusteného kyslíka.
- Vyčerpanie alebo inhibícia substrátu spomaľuje metabolizmus, znižuje spotrebu kyslíka a spôsobuje zvýšenie hladín rozpusteného kyslíka.
- Kontaminácia cudzími mikroorganizmami mení vzorec spotreby kyslíka, čo vedie k abnormálnym výkyvom rozpusteného kyslíka a slúži ako včasný varovný signál.
- Poruchy zariadenia, ako napríklad porucha miešadla, upchatie vetracieho potrubia alebo znečistenie filtra, môžu tiež viesť k abnormálnemu správaniu rozpusteného kyslíka.

Integráciou monitorovania rozpusteného kyslíka v reálnom čase do automatizovaného systému riadenia so spätnou väzbou je možné dosiahnuť presnú reguláciu hladín rozpusteného kyslíka prostredníctvom dynamických úprav nasledujúcich parametrov:
- Rýchlosť miešania: Zvýšenie rýchlosti zlepšuje kontakt medzi plynom a kvapalinou rozbíjaním bublín, čím sa zlepšuje účinnosť prenosu kyslíka. Toto je najbežnejšie používaná a najúčinnejšia metóda.
- Rýchlosť prevzdušňovania: Úprava prietoku alebo zloženia vstupného plynu (napr. zvýšenie podielu vzduchu alebo čistého kyslíka).
- Tlak v nádrži: Zvýšenie tlaku zvyšuje parciálny tlak kyslíka, čím sa zvyšuje rozpustnosť.
- Teplota: Zníženie teploty zvyšuje rozpustnosť kyslíka v kultivačnom médiu.

Odporúčania spoločnosti BOQU týkajúce sa produktov na online monitorovanie biologickej fermentácie: